Традиции вместо науки IV. Диагноз.

«Гранулёмы — значит тубик»

Если при исследовании рыбы в паренхиматозных органах обнаруживаются гранулёмы, следующая мысль часто возникает почти автоматически:

Микобактериоз.

Или ещё проще:

Рыбий туберкулёз.

Ассоциация понятна. При микобактериозах рыб гранулёмы действительно встречаются очень часто. Проблема начинается в тот момент, когда характерная реакция организма превращается в название возбудителя. Сначала стоит разобраться, что именно мы увидели.

Что такое гранулёма?

Одно из классических определений гранулёмы — компактное организованное скопление зрелых мононуклеарных фагоцитов, прежде всего макрофагов (крупных иммунных клеток, которые пожирают бактерии, вирусы и клеточный мусор).

Причём некроз (Необратимая гибель клеток), гигантские клетки (Очень крупные, обычно многоядерные клетки), лимфоциты (Разновидность иммунных клеток) и другие хорошо знакомые элементы гранулёмы могут присутствовать, но не являются обязательными. Важен сам факт организованного скопления зрелых макрофагов (Pagán & Ramakrishnan, 2018).

Современное определение можно упростить:
Гранулёма — это организованная попытка макрофагов справиться с тем, с чем один макрофаг справиться не смог.

Pagán и Ramakrishnan предлагают очень наглядную модель:

• Если первичный фагоцит захватил объект и смог его уничтожить — соответственно гранулёма не нужна.

• Если объект сохраняется, плохо разрушается или слишком велик, начинают привлекаться другие клетки и формируется уже организованная структура (Pagán & Ramakrishnan, 2018).

То есть само появление гранулёмы прежде всего говорит:

что-то здесь оказалось достаточно стойким, чтобы обычной фагоцитарной реакции (Защитный ответ иммунной системы, при котором клетки (фагоциты, например, макрофаги) распознают, поглощают и переваривают чужеродные частицы, бактерии и отмершие клетки) оказалось недостаточно.

Не обязательно даже «чужое»

Ещё в 1925 году Margaret Reed Lewis наблюдала за поведением моноцитов в культуре. Эти клетки реагировали не только на туберкулёзные бактерии или искусственно добавленные частицы угля.

Они также захватывали:

• собственные гранулы меланина (Гранулы меланина представляют собой крошечные внутриклеточные капсулы-контейнеры (органеллы), которые хранят и транспортируют меланин — природный темный пигмент);
• погибшие гранулоциты (Разновидность лейкоцитов (белых клеток крови), внутри которых содержатся крупные гранулы (капсулы) с активными веществами для борьбы с микробами и воспалением.);
• эритроциты (Красные кровяные тельца, которые переносят кислород от лёгких ко всем органам и тканям, а обратно забирают углекислый газ.).

В процессе культивирования моноциты превращались в макрофаги (Крупные иммунные клетоки, которые пожирают бактерии, вирусы и клеточный мусор). Через несколько суток клетки, захватившие трудноудаляемый материал, приобретали эпителиоидную форму, а некоторые объединялись, образуя многоядерные гигантские клетки (Pagán & Ramakrishnan, 2018).

Получается, что для развития гранулематозной реакции принципиально не только деление на «своё» и «чужое».

Важен другой вопрос:

можно это быстро удалить или нельзя?

Погибшая клетка не становится «инородным телом» в буквальном смысле. Она остаётся собственным материалом организма. Но после разрушения клетки остаются мембраны (Тончайшие гибкие оболочки из жиров и белков, которые окружали клетку и её внутренние органеллы, отделяя их от внешней среды.), липиды (Обширная группа природных жиров и жироподобных веществ, которые не растворяются в воде, но хорошо растворяются в органических растворителях), белки (сложные природные органические соединения, состоящие из цепочек аминокислот, которые служат главным строительным материалом и инструментами для всех процессов в организме.) и другой клеточный детрит («мусор» из остатков разрушенных клеток и тканей, который образуется в организме после их гибели, воспаления или травмы.), который необходимо убрать. Если этот материал долго сохраняется в тканях, фагоциты ( К фагоцитам относятся уже знакомые вам макрофаги, моноциты, а также нейтрофилы) продолжают реагировать на его присутствие, пытаясь захватить и удалить остатки разрушенных клеток. Такая реакция может затягиваться и становиться частью хронического гранулематозного воспаления.

Поэтому формула:

«гранулёма = инфекционный агент»

изначально слишком проста.

Механизм древнее рыб

Гранулематозная реакция вообще оказалась значительно древнее, чем можно было бы ожидать от сложной системы клеточного иммунитета позвоночных. Гранулёмы формируют не только млекопитающие, птицы или рыбы. Они описаны у моллюсков, червей и насекомых (Pagán & Ramakrishnan, 2018). Есть особенно красивый пример. Паразитоидная оса откладывает яйцо в личинку дрозофилы. Яйцо слишком велико, чтобы отдельный фагоцит мог его поглотить. Тогда клетки окружают его и формируют организованную гранулематозную структуру. То есть задача остаётся той же:

не можешь уничтожить — изолируй.

У пресноводного моллюска Corbicula fluminea гранулёматозная реакция может возникать даже вокруг собственных личинок, которые по какой-либо причине не были нормально выведены из организма. Впоследствии их остатки постепенно резорбируются (Pagán & Ramakrishnan, 2018).Трудно придумать более наглядный пример того, почему гранулёма сама по себе ничего не говорит о микобактериях.

Причин может быть много

Гранулематозную реакцию могут вызывать совершенно разные агенты. В обзоре Pagán и Ramakrishnan среди инфекционных причин перечисляются бактерии, грибы, простейшие, гельминты и вирусы. Кроме того, гранулёмы возникают вокруг инородного материала и при целом ряде неинфекционных воспалительных процессов (Pagán & Ramakrishnan, 2018).

Поэтому логическая цепочка:

гранулёма → микобактерия

не работает.

Правильнее:

гранулёма → длительно сохраняющийся фактор → выясняем, какой именно.

Для аквариумной практики микобактериоз при множественных гранулёмах действительно будет одним из первых вариантов, который следует проверить. Но первый дифференциальный диагноз — ещё не установленный диагноз.

Микобактерии

С микобактериями всё становится ещё интереснее. Очень долго гранулёму представляли почти как крепость, которую организм строит вокруг бактерии:

вот бактерии, вот вокруг них стенка из иммунных клеток — инфекция локализована.

Такой механизм действительно существует. Но оказалось, что это только половина картины. Исследования Mycobacterium marinum на данио показали, что патогенные микобактерии способны использовать сам процесс образования гранулёмы :

Инфицированный макрофаг привлекает новые макрофаги. Он погибает. Другой макрофаг поглощает его остатки — вместе с находящимися внутри бактериями. Теперь заражён уже следующий макрофаг. Он тоже становится частью гранулёмы. В экспериментах количество инфицированных макрофагов начинало резко возрастать именно после формирования клеточных агрегатов. Одновременно увеличивалось и количество жизнеспособных микобактерий (Pagán & Ramakrishnan, 2015).

Получается почти парадокс:
организм собирает клетки, чтобы локализовать инфекцию, а бактерия использует приходящие клетки как новые места для размножения.

Причём зрелая гранулёма оказывается не обязательно герметичной капсулой. Клетки продолжают входить в неё и выходить из неё, а инфицированные макрофаги способны покидать первичный очаг и участвовать в формировании новых. (Pagán & Ramakrishnan, 2015)

Поэтому современное представление о гранулёме намного интереснее старого:

гранулёма одновременно может ограничивать инфекцию и помогать возбудителю распространяться.

Что именно происходит, зависит от стадии процесса, состояния иммунного ответа и свойств самого возбудителя.

Много гранулём — много бактерий?

Не обязательно.

Гранулёма отражает не просто количество возбудителя. Она отражает характер взаимодействия организма с ним. При эффективной организации клеточной реакции могут сформироваться хорошо выраженные гранулёмы. При нарушении работы макрофагов очаги могут становиться дезорганизованными и некротическими, при этом бактериальная нагрузка способна быть очень высокой.
В экспериментальных моделях при нарушении действия фактора некроза опухоли (TNF) — сигнального белка, с помощью которого иммунные клетки регулируют воспаление и защиту от инфекции, — микобактерии начинали активно размножаться, а гранулёмы теряли свою организованную структуру (Pagán & Ramakrishnan, 2015).

Поэтому ситуация: “генерализованный микобактериоз, но красивых многочисленных гранулём почти нет” - вовсе не противоречива. Иногда это может означать как раз обратное: иммунитет, как система локализации инфекции, работает плохо.

А если покрасить по Цилю–Нильсену?

Вот здесь мы переходим от предположения к следующему уровню доказательности.

Если в гранулёмах обнаруживаются многочисленные палочковидные бактерии, сохраняющие карболовый фуксин после кислотного обесцвечивания, гипотеза микобактериоза становится значительно сильнее. Но и здесь важно не перепрыгнуть ещё через одну ступень. Окраска по Цилю–Нильсену выявляет кислотоустойчивость. Она не определяет автоматически вид бактерии.

Подробнее здесь: Традиции вместо науки I. Метод: окраска и границы её интерпретации

Для видовой идентификации уже потребуются другие методы — культуральное исследование, ПЦР, секвенирование или их сочетание.

Гранулёма говорит:

идёт организованная хроническая тканевая реакция.

Окраска говорит:

здесь присутствуют структуры с определёнными тинкториальными свойствами.

Молекулярный или культуральный метод уже позволяет приблизиться к вопросу:

кто именно здесь находится?

Одно не заменяет другое.

Иногда гранулёма оказывается вообще не про бактерии

Перед нами две селезёнки рыб с многочисленными беловатыми очагами. В первом случае при микроскопии обнаружены микобактерии. Во втором — внутриклеточные микроорганизмы, морфологически напоминающие Histoplasma.

Первый снимок приведён специально для сравнения. Внешне оба органа имеют сходные изменения, но микроскопия показывает совершенно разные находки. Именно поэтому наличие множества беловатых узелков ещё не позволяет определить их причину.

Можно встретить множество гранулематозных очагов и не обнаружить в них кислотоустойчивых бактерий. Причиной могут оказаться совершенно другие процессы — например, паразитарные поражения. Именно поэтому сначала лучше описать то, что действительно видно:

«множественные гранулёмы»

а уже потом выяснять их этиологию.

Потому что запись:

«множественные гранулёмы — микобактериоз»

незаметно превращает наблюдение в диагноз.

Форма гранулёмы тоже имеет значение

Печень Apteronotus albifrons с гранулематозными очагами (кислотоустойчивые бактерии выявлены):

Конкременты в почке неона. Микроскопический препарат почки неона. Округлые и овальные образования различного размера с чёткими контурами и неоднородным содержимым, предположительно минеральные конкременты. Некоторые окружены клеточными структурами, напоминающими гранулематозную реакцию. Микобактерии не выявлены, аналогичные образования в других органах не обнаружены.

Гранулёма — это не просто “узелок” в ткани. Важно и то, как она организована. Морфология очага нередко зависит от того, что находится в его центре и сколько таких центров вообще имеется. Условно можно выделить несколько вариантов.

1. Один компактный центр Если инициирующий фактор невелик, реакция может организоваться вокруг одного центра и давать сравнительно округлую, компактную гранулёму.

2. Большой или неправильный по форме центр Если в основе лежит крупный, неровный или плохо удаляемый объект — например, паразитарная структура, конкремент или массивный участок тканевого распада — гранулёма часто повторяет его контуры и становится менее правильной по форме.

3. Два соседних центра Иногда в ткани расположены два близких очага. Их наружные зоны реакции могут сливаться, создавая впечатление одной сложной гранулёмы. Но наличие двух отдельных центров говорит о том, что это две сближенные гранулёмы, а не одна неправильная.

Некротическая и ненекротическая гранулёма

Фиброзные узловые образования в почках пескаря (Gobio gobio). Размер обнаруженных образований — от 0,5 до 8 мм. Центральная часть представленных образований имеет однородную структуру. Кислотоустойчивые бактерии не выявлены.

Ещё один важный признак — есть ли в центре некроз.

Если клетки в центре гранулёмы разрушаются и образуют бесструктурную массу, такую гранулёму называют некротической.

Центральный некроз характерен для многих микобактериальных гранулём, но встречается и при других заболеваниях. При этом микобактериоз может протекать и без некроза.

При некоторых грибковых и паразитарных поражениях можно видеть многочисленные хорошо организованные гранулёмы без центрального некроза — даже при тяжёлом генерализованном процессе.

В пределах одного эпизоотического процесса гранулёмы часто имеют сходное строение. Если один и тот же агент поражает однородную группу рыб, тип гранулёматозной реакции — форма, выраженность капсулы, наличие или отсутствие некроза — может повторяться достаточно закономерно. Однако этот морфотип (Совокупность внешних признаков, особенностей строения и формы организма (или клетки), характерных для определенной группы.) характеризует взаимодействие конкретного возбудителя с конкретным хозяином, а не является универсальным свойством возбудителя.

Что окружает гранулёму?

Важно смотреть не только на центр гранулёмы, но и на её периферию. В одних случаях граница с окружающей тканью выражена слабо. В других очаг окружён несколькими слоями макрофагов, других воспалительных клеток и соединительнотканных элементов.

Со временем вокруг гранулёмы может формироваться плотная соединительнотканная капсула. Её толщина и выраженность зависят от длительности процесса, природы раздражителя и реакции тканей организма.

Где здесь «традиции вместо науки»?

Не в самой связи гранулём с микобактериозом. Эта связь существует и практически очень полезна. Проблема появляется, когда вероятная причина становится единственно возможной просто потому, что мы привыкли видеть их рядом.

Схема: «увидел гранулёму → написал “туберкулёз”» - экономит время.

Но она выбрасывает всю самую интересную часть диагностики. Что сформировало гранулёму? Есть ли внутри неё бактерии? Кислотоустойчивы ли они? Есть ли вообще инфекционный агент? Что происходит с окружающей тканью? Это локализованный процесс или генерализованный? И только после этого появляется право двигаться от морфологического признака к диагнозу.

Гранулёма — не диагноз.
Это след работы организма.
А задача диагностики — выяснить, из-за чего эта работа понадобилась.

Литература

Pagán, A.J., Ramakrishnan, L., 2018. The Formation and Function of Granulomas. Annual Review of Immunology 36, 639–665.
https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032712-100022

Обзор формирования и функций гранулём. Рассматриваются определение гранулёмы, её эволюционное происхождение, инфекционные и неинфекционные причины, реакции на инородные и собственные плохо удаляемые структуры, а также защитная и патологическая роль гранулематозного ответа.

Pagán, A.J., Ramakrishnan, L., 2015. Immunity and Immunopathology in the Tuberculous Granuloma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine 5, a018499.
https://doi.org/10.1101/cshperspect.a018499

Обзор взаимодействия микобактерий с гранулёмой. На моделях, включая Mycobacterium marinum у данио, показано, что гранулёма не только ограничивает инфекцию: микобактерии могут использовать привлечение и гибель макрофагов для размножения и распространения.

См. также

Гексамитиды ГексамитидыПочему гексамитиды не являются нормальной микрофлорой кишечника рыб, откуда берётся миф о «внутренних паразитах», и как на самом деле … Fossa Method. Fossa Method.Наблюдение, ограничения, модели, понимание и поиск механизмов. Попытка сформулировать принципы, которые лежат в основе диагностики, … Газопузырьковая болезнь. Часть II.
Последствия. Газопузырьковая болезнь. Часть II. Последствия.Сравнение нормы и патологии при вскрытии рыб: печень, почки, жабры и головной мозг. Как отличать допустимые варианты от признаков застоя, … Здоровье не означает стерильность Здоровье не означает стерильностьПочему присутствие микроорганизмов и паразитов не всегда означает болезнь, иммунитет не обязан уничтожать их полностью, а применение … Хирургические операции на гидробионтах Хирургические операции на гидробионтахРуководство по проведению хирургических операций на рыбах Две стороны одной дозировки Две стороны одной дозировкиЛекарства в аквариумистике: спасение или угроза? Разбираем плюсы и минусы антибиотиков, формалина, метиленовой сини и малахитового зелёного.

Галерея микроскопии Смотреть все изображения →