Окраска без фенола: что меняется в методе и выводах

Если изменить окраску, что останется от результата?

В диагностике есть соблазн воспринимать методику как набор обязательных действий. Не оказалось одного реагента — значит, выполнить метод нельзя и препарат уже ничего не расскажет.

Но здесь смешиваются два вопроса: можно ли провести стандартный тест и можно ли получить из препарата полезное наблюдение. Ответы на них не всегда совпадают.

Хороший пример — окраска по Цилю–Нильсену, которую применяют для выявления кислотоустойчивых бактерий, в том числе микобактерий. В классических вариантах используют карболовый фуксин, нагревание, кислотное или кислотно-спиртовое обесцвечивание и контрастную окраску. Каждый этап выполняет свою функцию.

Если какой-то этап изменить, нужно понять, какую информацию мы сохранили, а какую потеряли.

Что происходит при окрашивании

Фуксин окрашивает структуры препарата. Фенол и нагревание в классическом варианте способствуют проникновению красителя, в том числе в бактерии, которые плохо окрашиваются обычными способами.

Затем наступает принципиально другой этап: обработка кислотой. Она удаляет краситель из одних структур, тогда как другие продолжают удерживать его в заданных условиях. Именно так выявляют кислотоустойчивость — способность сохранить окраску после определённой обесцвечивающей обработки.

Контрастный краситель помогает различать ткани и фон.

Значит, исключение фенола и исключение кислоты — не равноценные изменения. В первом случае мы меняем условия первичного окрашивания. Во втором — убираем саму проверку кислотоустойчивости.

Нагревание: 40, 60 градусов или до кипения?

В классическом методе Циля–Нильсена нагревают уже нанесённый на препарат карболовый фуксин, обычно до начала появления паров. В некоторых руководствах этот ориентир связывают приблизительно с 60 °C. Краситель выдерживают нагретым несколько минут (часто 3–5 минут), не давая ему закипеть или высохнуть ( протокол ASM; сравнительное исследование).

Но появление паров — это не кипение: жидкость испаряется и при меньших температурах. Поэтому «до паров» служит лишь приблизительным ориентиром, а не точным способом контроля нагрева. Для воспроизводимой модификации лучше фиксировать измеренную температуру красителя, время выдержки и его концентрацию.

Почему же не нагреть сильнее? Кипячение не входит в цель метода: оно ускоряет испарение, может привести к высыханию и разбрызгиванию красителя. При использовании фенола это ещё и вопрос химической безопасности. Отдельно следует различать термофиксацию препарата до окрашивания и нагревание красителя во время окрашивания — это разные операции.

У фенол-свободных вариантов режим иной. В одних исследованиях брали 0,5%-й водный фуксин при 60 °C на 15 минут; в методе GASMoC — 1%-й водный фуксин при 37 °C на 15 минут. Следовательно, работа при 37–40 °C в принципе возможна, но 40 °C не является универсальной проверенной температурой: каждый режим нужно оценивать вместе с концентрацией красителя, экспозицией и типом препарата. Эти результаты относятся к конкретным исследованиям, а не устанавливают взаимозаменяемость всех условий.

Можно ли обойтись без фенола?

Да, при определённых условиях. Это подтверждается исследованиями, а не только отдельными наблюдениями.

Della Speranza и Fail (2000) показали, что 0,5%-й водный раствор основного фуксина без фенола способен окрашивать микобактерии при 60 °C за 15 минут. При комнатной температуре в их условиях тот же подход работал значительно хуже. Следовательно, важен не только состав, но и режим воздействия красителя ( работа 2000 года).

McCollough (2008) применила окрашивание 0,5%-м водным фуксином при 60 °C за 15 минут при исследовании возбудителей заболеваний водных животных, включая Mycobacterium marinum в почке золотой рыбки ( исследование).

Gomes и соавторы (2020) сравнили стандартную и модифицированную фенол-свободную окраску с применением 1%-го водного фуксина при 37 °C в течение 15 минут на клинических образцах и на ткани данио-рерио с M. marinum. В исследованной выборке новая схема не уступала стандартной по обнаружению кислотоустойчивых бактерий; однако выборка была небольшой, и переносить этот результат на любые материалы и условия нельзя ( исследование GASMoC).

Во всех этих случаях важно одно: кислотное обесцвечивание сохраняли. Авторы меняли первичный краситель, но не отказывались от проверки того признака, ради которого проводят тест.

Таким образом, отсутствие фенола само по себе не делает выявление кислотоустойчивых бактерий невозможным. Но конкретный вариант окраски должен иметь проверенные условия и контроль результата.

Что происходит, если убрать кислоту?

Предположим, после интенсивного окрашивания фуксином в ткани видны красные палочковидные бактерии. Можно рассмотреть их форму, примерное количество, распределение и связь с изменёнными участками органа.

Но если кислотного обесцвечивания не было, кислотоустойчивость не исследовалась. Здесь уже нельзя написать «выявлены кислотоустойчивые бактерии», как бы убедительно они ни выглядели.

У такого изменения есть и обратная сторона. Кислота может убирать окраску не только с фона, но и со структур, которые было бы интересно увидеть. Без неё поле зрения может стать более «грязным», зато сохранятся дополнительные объекты. Это удобно для поискового наблюдения, но снижает избирательность метода.

Поэтому окраска без кислотного обесцвечивания — не упрощённый Циль–Нильсен. Это другая процедура с другим кругом допустимых выводов.

Один орган — три способа

Для собственного сравнения я использовал препараты одной селезёнки скалярии с многочисленными светлыми очагами. Их окрашивали по трём схемам:

1. С фенолом и последующим кислотным обесцвечиванием.
2. Без фенола, но с обесцвечиванием 5%-й серной кислотой.
3. Без фенола и без кислотного обесцвечивания.

Все препараты снимались на одном микроскопе с одной камерой.

Во всех трёх случаях наблюдались сходные красные палочковидные бактерии. Это согласуется с возможностью окрашивания без фенола, в том числе с сохранением окраски после обработки кислотой.

Однако препараты одного органа не позволяют рассчитать чувствительность, специфичность или доказать равноценность трёх схем. Это сравнение наблюдаемых результатов, а не валидация новой диагностической методики.

А если использовать другую кислоту?

В исторических и современных вариантах кислотоустойчивой окраски применяли разные кислоты и режимы обесцвечивания. Поэтому одна конкретная кислота не является универсальной и незаменимой частью всех вариантов метода ( обзор Vilchèze и Kremer, 2017).

Но из этого не следует, что любой кислый раствор даёт одинаковую проверку. Вид кислоты, концентрация и продолжительность обработки влияют на то, какие структуры потеряют окраску.

Например, концентрированный раствор лимонной кислоты можно рассматривать как экспериментальный деколоризатор. Даже если фон обесцветился, а палочки остались красными, такой результат ещё не равнозначен стандартному тесту. Для сравнения потребуются подходящие положительные и отрицательные контрольные препараты.

Отрицательная окраска тоже имеет границы

Есть ещё одна причина не превращать результаты окраски в окончательный диагноз.

Даже микобактерии не всегда демонстрируют одинаковую кислотоустойчивость. У Mycobacterium tuberculosis описаны состояния, при которых часть клеток плохо выявляется или не выявляется обычным способом. Это обсуждается в работе о так называемом «парадоксе Коха» ( Vilchèze и Kremer, 2017).

Для диагностики рыб отсюда следует осторожный принцип: отрицательная окраска сама по себе не доказывает отсутствие микобактерий. Но нельзя и объяснять любую отрицательную окраску тканей рыбы «спящими» микобактериями. Это только одна из возможных причин, требующая проверки.

И наоборот, положительная кислотоустойчивая окраска не определяет автоматически род и вид бактерий. Для идентификации может понадобиться дополнительное исследование, например ПЦР или культуральный метод.

Как правильно сформулировать находку

Если использовали фуксин с нагреванием, но не проводили кислотное обесцвечивание, корректно описать и процедуру, и то, что видно:

Использована модифицированная окраска фуксином с нагреванием без кислотного обесцвечивания. В ткани обнаружены интенсивно окрашенные палочковидные бактерии. Их кислотоустойчивость не оценивалась.

Вместо этого нельзя заявлять, что выполнена стандартная окраска по Цилю–Нильсену и доказано наличие кислотоустойчивых бактерий.

Главное различие: отсутствие отдельного этапа не обнуляет полученные наблюдения, но меняет границы выводов. Метод — не заклинание с неизменными словами, а последовательность действий, каждое из которых должно отвечать на конкретный вопрос.

За историей модификаций, точными режимами исследований и подробной библиографией можно обратиться к полной версии F.O.S.. А версия F. рассказывает ту же историю совсем без лабораторных подробностей.

См. также

Традиции вместо науки I.
Метод. Традиции вместо науки I. Метод. Что можно получить от окраски, если классический метод Циля–Нильсена невозможно выполнить полностью? Разбираем роль фенола, нагревания и … Традиции вместо науки IV.
Диагноз. Традиции вместо науки IV. Диагноз.Гранулёмы, некроз и микобактериоз рыб: почему сходные морфологические признаки не означают одинаковую этиологию и не могут служить … Cryptocaryon irritans. Паразит, а
не просто белые точки Cryptocaryon irritans. Паразит, а не просто белые точкиНаучно обоснованный разбор биологии Cryptocaryon irritans: жизненный цикл, терминология tomont, theront, trophont, миф о «вездесущем … Гранулёмы и внутриклеточные агенты
у рыб Гранулёмы и внутриклеточные агенты у рыбПодборка реальных наблюдений: дрожжеподобные внутриклеточные структуры, эймерии, криптоспоридии и грибные формы у рыб. Cryptococcus-like структуры у рыб Cryptococcus-like структуры у рыбОкруглые структуры с выраженным halo, морфологически сходные с криптококками. Разбор морфологии и ограничений интерпретации. Кокцидии у рыб: Goussia Кокцидии у рыб: GoussiaКокцидии рода Goussia у рыб. Морфология ооцист, спороцист и споразоитов, диагностика и интерпретация микроскопических находок.

Галерея микроскопии Смотреть все изображения →