Красные палочки: зачем я изменил привычный метод

Когда красные палочки важнее названия метода

Представьте: вы смотрите в микроскоп на ткань больной рыбы. Видите клетки, какие-то пятна, обломки тканей. Но есть ли среди всего этого бактерии? Непонятно.

В обычной лаборатории для таких случаев существуют специальные окраски. Краситель помогает выделить то, что почти невозможно различить в бесцветном препарате.

В нашем случае мы используем фуксин — краситель, который придаёт некоторым клеткам и бактериям ярко-красный цвет. Благодаря этому под микроскопом становятся заметны структуры, которые без окрашивания трудно различить. В классическом методе к фуксину добавляют фенол — химическое вещество, которое само ничего не окрашивает, но помогает красителю проникать в трудно окрашиваемые структуры бактерий. Такая смесь называется карболовым фуксином.
Важен и нагрев. При обычной окраске по Цилю–Нильсену краситель осторожно прогревают до появления лёгких паров — ориентировочно до 60 °C. Кипятить его не нужно. Тепло помогает фуксину окрашивать бактерии, но это не значит, что чем горячее, тем лучше.
После окрашивания препарат обрабатывают кислотой. Она удаляет краситель из многих структур, но некоторые бактерии сохраняют красную окраску. Именно так проверяют их кислотоустойчивость — способность удерживать краситель после обработки кислотой.

Только вот нужные реактивы есть не всегда. И что тогда — убрать препарат и признать, что узнать ничего нельзя?

Хочется проверить другое: что можно увидеть, если изменить привычный способ окрашивания? И главное — что после этого можно честно сказать о результате?

Одна скалярия и три препарата

Возьмём селезёнку скалярии с многочисленными светлыми точкими. Приготовим из этого материала препараты и окрасим их тремя способами.

В первом случае используем привычную схему: специальный краситель с фенолом, а затем кислоту. Во втором — уберём фенол, но оставим обработку кислотой. В третьем — не используем ни фенол, ни кислотное обесцвечивание.

Зачем всё это? Не ради нового названия для старого метода. Мы увидим, насколько важен каждый его этап.

Результат оказался наглядным. Во всех трёх вариантах хорошо заметны небольшие красные палочки, похожие по форме и расположению.
Для сравнения используем один микроскоп и одну камеру.

Это не большое научное исследование, а сравнение нескольких препаратов из одного органа. По таким снимкам нельзя объявить три способа одинаково надёжными. Но они показывают одну полезную вещь: если изменить рецепт, результат не обязательно исчезнет.

Почему кислоту нельзя просто вычеркнуть

Здесь есть важная тонкость.

Некоторые бактерии способны сохранять красную окраску даже после обработки кислотой. Это свойство называют кислотоустойчивостью. Именно его проверяет известный лабораторный метод Циля–Нильсена.

Если кислотой препарат не обрабатывали, проверка не состоялась. Пусть палочки выглядят совершенно так же, как в другом препарате, — мы не имеем права назвать их кислотоустойчивыми только по цвету.

Но разве это означает, что увиденные палочки бесполезны? Нет. Мы по-прежнему можем рассмотреть их форму, количество, расположение и то, в каких участках ткани они встречаются.

Получается простая разница:

Увидеть бактерии — одна задача. Проверить их кислотоустойчивость — другая. Определить, какие именно это бактерии, — третья.

Одна фотография не решает все три задачи сразу.

А фенол зачем?

Фенол входит в состав привычного красителя и помогает окрашиванию. Но «помогает» не означает «без него невозможно».

Исследователи уже показывали, что при определённых условиях бактерии можно окрашивать фуксином без фенола. И здесь неожиданно важной оказалась температура. Например, водный фуксин успешно применяли при 60 °C в течение 15 минут, в том числе на тканях рыб ( McCollough, 2008). А в другом исследовании обошлись всего 37 °C за те же 15 минут, изменив концентрацию красителя ( Gomes и соавт., 2020). В обоих случаях последующее кислотное обесцвечивание сохраняли.

Получается, вопрос «до 40, до 60 или до кипения?» нельзя решить одной цифрой. Результат зависит также от состава раствора и времени окрашивания. Температура 37 °C была проверена в конкретной методике; это не доказательство, что всякая окраска сработает при 40 °C. А кипячение вовсе не требуется.

То есть вопрос не в том, хорош фенол или плох. Вопрос в том, какую работу он выполняет и можно ли добиться нужного результата иначе.

Почему это важно

Когда занимаешься диагностикой, иногда не хватает не только реактивов, но и времени, оборудования или возможности сразу отправить образец в лабораторию.

В такой ситуации легко впасть в одну из двух крайностей. Первая: «Ничего нельзя сделать правильно, значит, ничего и не будем смотреть». Вторая: «Вижу красные палочки — значит, диагноз установлен».

Обе мешают думать.

Микроскоп может дать полезную информацию даже тогда, когда окончательный ответ пока недоступен.
Нужно только не приписывать увиденному больше, чем оно доказывает.

Метод можно изменить. Но тогда надо заново спросить себя: “что я действительно проверил, что увидел и чего пока не знаю?”

В этом и заключается разница между работой по инструкции и пониманием того, зачем эта инструкция существует.

Если хочется разобраться глубже: почему окраска работает и где проходят границы выводов или полный разбор с историей метода, опытами и источниками.

См. также

Грибные структуры у рыб:
колонизация или инвазивный процесс Грибные структуры у рыб: колонизация или инвазивный процессГрибные структуры у рыб могут отражать как поверхностную колонизацию, так и инвазивный процесс. В статье рассматриваются морфологические … Fossa Method. Fossa Method.Наблюдение, ограничения, модели, понимание и поиск механизмов. Попытка сформулировать принципы, которые лежат в основе диагностики, … Cryptocaryon irritans. Паразит, а
не просто белые точки Cryptocaryon irritans. Паразит, а не просто белые точкиНаучно обоснованный разбор биологии Cryptocaryon irritans: жизненный цикл, терминология tomont, theront, trophont, миф о «вездесущем … Две стороны одной дозировки Две стороны одной дозировкиЛекарства в аквариумистике: спасение или угроза? Разбираем плюсы и минусы антибиотиков, формалина, метиленовой сини и малахитового зелёного. Криптокарионоз: убиваем паразита или
лечим воду? Криптокарионоз: убиваем паразита или лечим воду?Практический разбор лечения криптокарионоза у морских рыб: почему уничтожение паразита не должно становиться важнее состояния самой рыбы, … Гранулёмы и внутриклеточные агенты
у рыб Гранулёмы и внутриклеточные агенты у рыбПодборка реальных наблюдений: дрожжеподобные внутриклеточные структуры, эймерии, криптоспоридии и грибные формы у рыб.

Галерея микроскопии Смотреть все изображения →